大阪大学産業科学研究所の永井健治教授らの研究グループは、鶴岡市立加茂水族館から提供された日本産ハナガサクラゲから、pH4.5-9.0の細胞環境で安定して蛍光 する、耐酸性の緑色蛍光タンパク質“Gamillus”の開発に成功しました。

今回研究グループは、ハナガサクラゲの光る触手から、蛍光タンパク質 をコードする遺伝子を新規に同定し、タンパク質工学を用いて遺伝子改良することで、耐酸性で単量体型、高輝度の緑色蛍光タンパク質Gamillus(Green fluorescent protein with acid-tolerance and monomeric property for illuminating soured environmentの略)を開発しました （図1） 。一般によく使われる、緑色蛍光タンパク質EGFP(オワンクラゲ由来)がpH6.0以下の酸性環境で蛍光を失うのに対して、Gamillusは酸性環境でも安定した蛍光を放ち、細胞内のほぼ全てのpH環境で使用可能です（ 図2 左）。Gamillusの立体構造をX線結晶解析法 で決定したところ、一般的なGFPとは異なるトランス型の蛍光発色団 を形成し、この構造が耐酸性メカニズムに寄与することを見いだしました（ 図1 右）。

酸性細胞小器官は、2016年のノーベル医学・生理学賞受賞者の大隅良典博士が発見したオートファジーなど、多くの生命機能に密接に関わっています。しかし、既存の緑色蛍光タンパク質は、低pHで蛍光しないため、酸性細胞小器官内での使用が限られていました。Gamillusを用いることにより、マクロオートファジーにより蛍光タンパク質が細胞質から酸性細胞小器官のリソソーム輸送される過程を観察することが可能になりました（ 図2 右）。将来的には、既存の耐酸性の青色・赤色蛍光タンパク質と組み合わせることで、複数種のタンパク質を別々の色で標識して、同時に追跡することが可能となります。Gamillusは、酸性環境中の未知の生命現象を発見するための基盤技術となり、医学・創薬研究にも大きく貢献すると期待されます。

図1
Gamillus作成の概略図。ハナガサクラゲの触手より、蛍光タンパク質の遺伝子をクローニングし、タンパク質工学により明るさや単量体度を改良した。（ハナガサクラゲは鶴岡市立加茂水族館の奥泉様よりご提供いただいた。）

図2
（左）pHと蛍光タンパク質の蛍光強度の相関図。（右）GamillusまたはEGFPを発現するHeLa細胞の蛍光画像。Gamillusを用いることで、マクロオートファジーによりタンパク質がリソソームへと輸送される過程を、蛍光で観察できるようになった。スケールバー：10μm.

細胞内にあるリソソームなどの酸性細胞小器官は、生体分子の修飾・輸送・分解から、細胞死誘導のコントロールなど、生命活動に幅広く重要な役割を担っています。2016年のノーベル医学・生理学賞を受賞した大隅良典博士が発見したオートファジーもその一例です。生体分子はオートファジーにより、リソソームへ輸送され分解・リサイクルされます。

蛍光タンパク質は酸性細胞小器官中の生体分子の機能を調べるための有効なツールの一つです。蛍光タンパク質で細胞内の特定の生体分子を標識してやれば、蛍光からその位置や動態を観察することができます。複数色の蛍光タンパク質を併用することで、複数種の生体分子を異なる色で光らせることができ、それぞれの機能を同時に調べることができます。しかし、現在報告されている蛍光タンパク質の多くは、pH6.0を下回る酸性環境では消失するといった問題点があります。青・赤色で耐酸性能をもつ蛍光タンパク質はいくつか報告されていますが、細胞観察に有用な耐酸性の緑色蛍光タンパク質の報告はありませんでした。したがって、酸性細胞環境中の複数の生体分子の相互関係を調査するためにも、耐酸性で緑色の蛍光タンパク質が強く求められていました。

本研究成果により、酸性細胞環境中の未知の生命現象の解明に貢献すると期待されます。たとえば、既存の耐酸性の青・赤色蛍光タンパク質と併用することで、複数種のタンパク質の機能を同時に解析することが可能になります。

また、Ca ²⁺ などの機能分子を検出するセンサーの作成も、将来的に応用可能です。これらのタンパク質・機能分子が関わる新たな疾病メカニズムの発見、また創薬スクリーニングへの貢献が期待されます。

本研究成果は、2017年12月29日（金）（日本時間）に「Cell Chemical Biology」（オンライン）に掲載されました。

タイトル：“Acid-tolerant monomeric GFP from Olindias formosa”
著者名：Hajime Shinoda, Yuanqing Ma, Ryosuke Nakashima, Keisuke Sakurai, Tomoki Matsuda and Takeharu Nagai

なお、本研究は国立研究開発法人科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業（CREST）「超解像「生理機能」イメージング法の開発と細胞状態解析への応用」、「異物排出輸送の構造的基盤解明と阻害剤の開発」、文部科学省科学研究費補助金新学術領域研究「少数性生物学」、「脳構築における発生時計と場の連携」の一環として行われました。